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環加成反應是化學合成中應用最廣泛的反應之一，可以有效實現雜環、螺環和橋環的手性構筑，其機理研究和結果預測是伍德沃德-霍夫曼規則和前沿軌道理論的重要成就。化學家們開發了多種金屬和小分子催化劑，用于催化環加成反應及其區域、立體選擇性的調控。自然界通過各種酶來實現這些環化反應，包括催化協同4+2環化的Diels-Alderases，但具有2+2環化酶活性的生物合成酶還沒有被發現。 

在前期的研究工作中，劉文課題組發現了兩步完全酶依賴的協同4+2環化反應，負責手性萘環和螺環的形成，用于吡咯吲哚霉素五環剛性骨架的構筑，為證實Diels-Alderase的天然存在提供了有力的證據（J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 17342-17345；Nat. Chem. Biol., 2015, 11, 259-265）。劉文課題組與潘李鋒課題組和K. N. Houk課題組合作，基于晶體結構和化學計算對相應酶促反應的協同發生機制進行了探究和驗證（Cell Chem. Biol., 2016, 23, 352-360；Cell. Chem. Biol. 2018, 25, 718-727；J. Am. Chem. Soc. 2020, 142 , 20232-20239；J. Am. Chem. Soc. 2022, 144 , 5099-5107）。在本研究中，作者在吡咯孢素（吡咯吲哚霉素的結構類似物）的生物合成途徑中發現了一個負責手性螺環形成的新型環加成酶。該酶為一類β-桶狀折疊的環化酶，不依賴光的激活，當以咯吲哚霉素中間體作為底物時，除了exo-和endo-4+2加成產物以外，還產生了exo-2+2加成產物。利用結構生物學和計算化學的手段，作者解析了該酶催不同環加成反應、實現區域和立體選擇性調控的分子機制，推導并驗證了經由雙自由基中間體、產生熱力學上有利的4+2和動力學上有利的2+2產物的反應過程。通過定向進化，作者對該酶的化學和立體選擇性進行了精準調控，獲得了分別催化exo-4+2、endo-4+2及exo-2+2單一環加成反應的突變蛋白。 

圖 β-桶狀蛋白催化的競爭性2+2/4+2環加成反應及基于選擇性調控的定向進化

該研究報道了罕見的非光激活的酶促2+2環加成反應，提供了一個通過酶與底物共進化的過程改善催化選擇性和酶活性的范例。論文的第一作者是王洪波、鄒一可、李淼和湯志軍，通訊作者是劉文、潘李鋒和Ken. N. Houk。該工作得到科技部、國家自然科學基金委、中科院及上海市科委等基金的支持。