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先前的實驗研究表明，一些羅丹明的非輻射衰變與TICT態的形成密切相關。因此，抑制可能的TICT形成是開發新的羅丹明衍生物的重要策略之一。在TICT狀態下，供體部分相對于熒光團核發生一個約90°的旋轉，變得無輻射和高度反應。為了抑制TICT，過去常常通過形成環狀結構使二烷基氨基供體分子剛性化。不幸的是，這種方法常常導致大分子結構生物相容性差。大連理工大學肖義、楊偉課題組和新加坡科技設計大學劉曉剛課題組用一個簡單的季銨哌嗪基取代四甲基羅丹明(TMR)中的二甲氨基。由此產生的N,N-二甲基哌嗪取代的羅丹明(MPR)使TMR的亮度加倍，并保持了良好的生物相容性。

染料中TICT的形成本質上受兩個因素控制:空間位阻和電子推拉效應。他們認為降低氨基的供電子強度會破壞TICT狀態的穩定，從而加強進入TICT狀態的能量屏障，可以抑制TICT的形成。因此注意到一個具有吸電性的季銨哌嗪基，帶正電荷的銨具有誘導作用，降低了鄰近氨基的供電子能力。那么用季銨哌嗪基取代二甲氨基應該能最大限度地減少TICT的形成。

之后通過計算一系列氨基分子的垂直電離能(VIEs)來支持了上述推論。TMR和MPR在水中勢能的結果表明，TICT的形成面相對于TMR (0.42 eV)具有更大的能量屏障蛋白(0.50 eV)。此外，在MPR (0.15 eV)中，驅動能量從局域激發態(LE)進入TICT狀態遠小于TMR (0.60 eV)。因此，MPR形成TICT的可能性應小于TMR形成TICT的可能性。這些理論計算支持作者通過實驗驗證了季銨哌嗪在提高羅丹明亮度方面的策略。因此通過之前報道的哌嗪羅丹明的有效N-烷基化反應合成了MPR。光譜研究表明,MPR在水溶液中相比 TMR(Φ= 0.47;ε= 7.8×10⁴ M^?1cm^?1)顯示出量子產率(Φ= 0.93) 顯著提高和摩爾消光系數(ε= 8.7×10⁴ M^?1 cm^?1) 顯著增加。

圖1. (a)導致發射態和非發射態的勢能剖面示意圖。(b)真空中各氨基的垂直電離能。(c) TMR和MPR在水中的勢能面。(d)季銨哌嗪熒光團及其二甲胺類似物的光譜特性。（圖片來源： J. Am. Chem. Soc.）

之后作者進一步比較了單分子水平上MPR和TMR的熒光。通過羧基位置相同，MPR和TMR均與免疫球蛋白G (IgG)偶聯，并吸附在表面上，因此可以研究它們在水溶液條件下的單分子特性。兩種化合物的單分子分布很稀疏，避免了重疊。與TMR-IgG相比，MPR-IgG的單分子亮度(518±63)、總收集光子數(4.06±0.26)×10⁴)、信噪比(信噪比:8.51±0.32)、定位精度(10.08±0.19 nm)均有顯著提高。這些結果與系綜光譜研究和量子化學預測相吻合。此外，在PBS和圖像增強緩沖液中，在一系列條件下證實了MPR-IgG的增強光子效果。仿真研究表明，與TMR-IgG相比，MPR-IgG顯示了改進的基于局部化的超分辨率成像潛力。這些結果表明，季銨哌嗪策略有效地提高了羅丹明的亮度。

為了研究季銨哌嗪在超分辨率成像中的應用，作者在HeLa細胞中加入了免疫染色的微管。重建后的圖像出現了微管的扭曲和交叉，與傳統圖像相比，表現出了相當大的清晰度增強。對成像結果的比較表明，MPR的超分辨率成像能力優于TMR。

圖2. 將MPR和TMR的羧基衍生物偶聯到IgG分子上后的單分子熒光信號、熒光軌跡及分子特性。MPR-IgG和TMR-IgG單分子亮度在PBS (pH = 7.4)溶液中隨激光功率的變化。（圖片來源： J. Am. Chem. Soc.）

為了進一步探討MPR在活細胞中的適用性,作者設計了一個雙探測器——Mem-R(Φ= 0.64)來特殊性標記質膜，然后使用Mem-R對細胞膜進行超分辨率成像。重建后的圖像顯示了細胞膜的詳細結構，與傳統模糊圖像形成鮮明對比。進一步分析重建后，估計平均單分子亮度為984，平均定位精度為20.9 nm。作者注意到，Mem-R的單分子亮度可以與DiI(一種基于Cy3的商用膜跟蹤器)相當，這應該歸因于Mem-R的量子產量比DiI高得多。此外由于Mem-R優異的光物理特性，使得高密度單分子跟蹤實驗成為可能，也揭示了Mem-R在質膜上的非均勻擴散。這些結果表明，Mem-R可以對細胞膜進行高質量的超分辨率成像。

圖3. Mem-R的分子結構以及Mem-R染色的活HeLa細胞質膜超分辨率圖像。Mem-R在(b)中標記區域的高密度分子跟蹤，根據擴散系數對軌跡進行著色（圖片來源： J. Am. Chem. Soc.）

探針Lyso-R具有溶酶體靶向性且大部分是非質子化的，在中性pH下熒光強度較低，其質子化(pk1/2 =6.56)的結果是形成了一個高熒光的Lyso-RH，實現了季銨哌嗪策略。為了證實Lyso-RH的靶向性，使用溶酶體標記蛋白(Lamp-1)對活的HeLa細胞進行衍射受限共聚焦分析。在正常培養基下，活細胞溶酶體中反復出現暫時性分離信號。統計分析表明，Lyso-RH光開關的亮度超過了商用的Lysotracker Red探針。重建的圖像顯示了球狀溶酶體的真實形狀和大小，與衍射受限的圖像相比，其清晰度顯著提高。在超分辨率圖像中，溶酶體的寬度測量為70.3 nm，與電子顯微鏡報道的值相匹配。重建量化分析顯示與之前報告的結果相比較，空間分辨率高。此外，由于溶酶體中Lyso-RH在沒有過量圖像增強劑的情況下也具有持久的光敏作用，實現了長期的超分辨像，顯示了溶酶體在高空間分辨率下的異質運動。

圖4. Lyso-R的質子化在酸性溶酶體中原位生成Lyso-RH。以及 Lyso-RH染色的HeLa細胞溶酶體的超分辨率和常規圖像，彩色超分辨率圖像。（圖片來源： J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者探討了季銨哌嗪策略的推廣性。量子化學計算預測，這種策略可以運用到其它熒光團上，如萘酰亞胺和NBD染料，隨后的實驗表明亮度提高了77倍。

總結：綜上所述，大連理工大學肖義、楊偉團隊和新加坡科技設計大學劉曉剛團隊提出并證明了一種新的提高羅丹明染料亮度的策略，即以季銨鹽哌嗪為供體片段，降低推拉效應，抑制扭曲的分子內電荷轉移。新設計的MPR與傳統的TMR相比，亮度提高了1倍。在MPR的基礎上，進一步開發了細胞膜探針Mem-R和溶酶體探針Lyso-RH。其優異的熒光特性使其在單分子跟蹤和超分辨率成像實驗中獲得了成功的應用。這種季銨鹽化策略將會激發許多高性能熒光團和探針的發展，并極大地促進熒光成像技術的發展。

撰稿人：馮虹