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Figure 1. Lipstatin逆合成分析（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

KAS-III是典型的同源二聚體，可以催化各種基于硫酯的反應。最常見的KAS-III（如FabH in Escherichia coli），通常催化的是乙酰-CoA與丙二酰-ACP之間的脫羧形式的Claisen縮合（Figure 2）。

Figure 2. FabH催化的脫羧縮合反應（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

最近報道了一些另一種類型KAS-III，可以催化非脫羧形式的縮合反應。目前報導的這兩種（脫羧、非脫羧）KAS-III均是以同源二聚體的形式來催化反應。本文作者在Lipstatin生物合成中，發現了另一種全新的KAS-III：LstA、LstB以異源二聚體的形式來催化縮合反應，LstA、LstB共同催化C8與C14乙酰-CoA發生非脫羧形式的縮合，形成C22的脂肪骨架（Figure 3）。

Figure 3. LstA、LstB共同催化縮合反應 （圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

LstA、LstB以異源二聚體形式存在的發現：作者單獨表達LstA、LstB均無法獲得可溶性蛋白，但是共表達，卻能夠獲得可溶性蛋白。因此作者推測LstAB可能存在相互作用，經過多角度光散射（multiangle light scattering，MALS）分析確認這兩個蛋白的確通過非共價連接的方式形成了異源二聚體。

LstAB催化非脫羧縮合的驗證：C22長鏈骨架的構建，推測是C9長鏈與C14乙酰-CoA以脫羧的方式縮合，但實驗表明化何物1-CoA對于構建C22長鏈骨架是必須的，而且體內敲除負責催化脫羧縮合的酶Acyl-CoA carboxylase (ACCase)，Lipstatin的產率降低了80%，而且中間體2（Figure 1）也有所積累，但是隨后的同位素標記實驗發現，相比于化合物2 ,化合物3整合到Lipstatin中的量很低，因此作者推測化合物2很有可能不是縮合反應的直接前體。不要用紅色突出，微信中編輯后都看不出來了，要突出可以加粗

隨后作者合成了2-CoA，5-CoA，其中5-CoA可以在AntE的催化下轉化成3-CoA（Figure 5B,ⅠⅡ）,如果同時加入AntE，LstAB，最終可以檢測到化合物6（major）以及7（Figure 5B,Ⅳ）。隨后作者以1-CoA與2-CoA為底物，在LstAB催化下測活，僅檢測到了化合物6?；谝陨蠈嶒灲Y果，作者推測了以下可能的過程，LstAB可以催化化合物1-CoA及5-CoA與2-CoA發生非脫羧的縮合反應，其中 1-CoA與2-CoA為LstAB主要催化的的反應，化合物6及7可能是化合物4和8不穩定，發生脫羧的產物（Figure 4）。

Figure 4. LstAB體外測活及HPLC檢測結果（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

不穩定中間體4的追蹤：作者在進行LstAB催化1-CoA與2-CoA縮合反應的時間梯度實驗中，檢測到了兩個化合物4-Ⅰ,4-Ⅱ（Figure 5A），且兩個化合物不穩定，在30 min時產量達到最大值，隨后可能發生了降解，作者認為最有可能是化合物6未發生脫羧的前體。原本推測為1- CoA與2- CoA以兩種不同方式縮合產生的中間體4, 4’（Figure 5B, route a, route b）。但是化合物 4’ 與Lipstatin中C22長鏈骨架不符，因此推測這兩個峰最有可能是化合物4的異構體，經過串聯質譜解析，4-Ⅰ,4-Ⅱ的裂解方式是一致的，與作者的推測相符。

 Figure 5. A）LstAB催化1-CoA與2-CoA的縮合反應的時間梯度實驗 B）1-CoA與2-CoA兩種可能的縮合方式（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

識別LstAB的催化殘基：作者將LstAB與之前已經報導過的KAS-III-FabH進行序列比較，發現LstA中包含保守的催化三聯體Cys128α, His271α, Asn305α。作者將LstA中的催化三聯體分別進行了突變，其中LstA_N305ALstB無法獲得可溶性蛋白，因此推測Asn305α在LstALstB復合物中起著結構性作用。LstA_C128ALstB，LstA_H271ALstB失去了其原本的催化活性（Figure 6），作者認為，Cys128α很有可能負責與C8的共價連接。催化非脫羧KAS-III蛋白中均有一個保守的Glu殘基來進行α-C的去質子化，作者以此為參考，將LstAB中的相應Glu進行了突變，發現LstAB_E60A失去了催化活性（Figure 6），因此推測LstB的Glu60β可能行使α-C的去質子化的功能。

 Figure 6. LstAB突變體測活結果（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

LstAB進化系統分析：作者利用生物信息學手段對lstAB進行了分析，lstA和lstB為什么斜體 同源基因廣泛分布于各類細菌基因組中，這些發現表明LstAB這種以異源二聚體的形式催化非脫羧縮合的方式廣泛存在于與Lipstatin類似的天然產物生物合成中。

基于以上研究，LstAB的催化機理總結如下：LstA的Cys128α與C8長鏈反應形成C8 acyl-Cys128α LstAB中間體，LstB的Glu60β進行去質子化引發后續的親核加成反應（Figure 7）。

 Figure 7. 可能的LstAB催化機理（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

小結：上海有機所劉文課題組發現了在減肥藥前體Lipstatin的生物合成路徑中存在一種新型的KAS-III，以獨特的異源二聚體的形式催化非脫羧的縮合反應，并對其催化機理進行了詳細研究。這些發現對于Lipstatin類似物的生物合成研究有十分重要的指導意義。

撰稿人：超級瑪麗